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Prueba de Detección de Endotoxina Bacteriana (LAL-BET)

Bacterial Endotoxin Testing

La prueba de pirógenos, endotoxina, Lisado de amebocitos de Limulus (LAL), y la prueba de detección de endotoxina (BET por sus siglas en inglés) son términos utilizados como equivalentes para referirse al ensayo que se lleva a cabo en el laboratorio de microbiología. Las endotoxinas bacterianas son agentes inflamatorios muy potentes, incluso después de la esterilización, y consisten de una cadena de polisacáridos (azúcar) y una fracción lipídica, conocida como el lípido A, las cuales son responsables de producir fiebre, una disminución de la presión sanguínea, y la activación de la reacción inflamatoria y de coagulación en los pacientes que se han expuesto a estas toxinas. Las compañías de dispositivos médicos, farmacéuticas y de biotecnología deben controlar los ambientes productivos y limitar la exposición de sus productos a las fuentes de endotoxina, desde el recibo de la materia prima hasta el final del proceso productivo y deben cumplir con los requisitos regulatorios globales relacionados a los niveles de endotoxina en producto terminado que contacte tanto el líquido cerebroespinal como el sistema cardiovascular. La práctica común en estas industrias es demostrar el cumplimiento con el marco regulatorio mediante la Prueba de Detección de Endotoxinas (BET) como criterio de liberación de producto.

MCL emplea 3 metodologías de LAL en nuestro laboratorio de microbiología: Gel Clot, Cinético Turbidimétrico y Cromogénico.

 

Gel Clot

El método de Gel-Clot es un ensayo cualitativo (Pasa/Falla) de detección de endotoxinas. Es una excelente alternativa para los clientes que requieren probar un número limitado de muestras, quienes realizan pruebas de control de calidad a su materia prima o en aquellos casos en que no se requiere un resultado de endotoxina cuantitativo. En el método de Gel-Clot, la endotoxina desencadena una cascada de reacciones enzimáticas, las cuales resultan en una enzima coagulante activada. La formación de un coágulo gelatinoso es proporcional a la concentración de endotoxina en la muestra. Aunque aún se considera la prueba de referencia para la determinación de concentraciones de endotoxina, muchos clientes prefieren los métodos cuantitativos descritos a continuación.

 

Cinético Turbidimétrico

El método Cinético Turbidimétrico es un método cuantitativo de LAL, el cual puede medir de forma precisa la concentración de endotoxina de las muestras. El método Cinético Turbidimétrico es el más sensible de los ensayos de LAL, teniendo sensibilidades tan bajas como 0.001 EU/ml. El método Cinético Turbidimétrico es la elección general cuando se considera el costo, la velocidad de la prueba y la sensibilidad. En el ensayo Cinético Turbidimétrico, la proenzima en el LAL se activa cuando entra en contacto con las endotoxinas. La tasa de activación es directamente proporcional con la concentración de endotoxina presente en la muestra. El nivel de activación puede ser cuantificado de forma precisa a través de una reacción subsiguiente con un sustrato, la cual se mide de forma espectrofotométrica.

 

Cromogénico

 

El método cromogénico es otro ensayo cinético cuantitativo para la detección de endotoxinas bacterianas. Se mezcla una muestra con el reactivo de LAL/Substrato, se coloca en un lector de placas con incubadora y se monitorea el desarrollo de un color amarillo a través del tiempo. Es la naturaleza cromogénica de este método la que la hace la forma más apropiada de ensayo para parenterales de bajo volumen, vacunas, antibióticos y biológicos. El método cromogénico se ve menos afectado por sustancias y materiales inhibitorios que pueden interferir con los ensayos turbidimétricos y de Gel-Clot.